il team della Genetica molecolare e del Laboratorio analisi
I kit che useremo nei prossimi mesi per monitorare la situazione dell’infezione da SARS-CoV-2 dovranno garantire velocità, precisione e accuratezza dei risultati. Per questo motivo è in atto uno sforzo nazionale e internazionale per valutare i più adatti. Uno sforzo a cui il Neuromed sta partecipando attraverso indagini sierologiche utilizzando differenti metodiche. Siamo tornati a parlarne con la dottoressa Marianna Storto, Responsabile dell’Unità di Patologia Clinica.
A che punto siamo?
“Nel nostro laboratorio l’indagine sierologica per infezioni da SARS-CoV-2 è iniziata sperimentando i test rapidi (quelli da effettuare con una semplice puntura sul dito, ndr), che sin dall’inizio non hanno prodotto risultati sufficientemente convincenti. Successivamente abbiamo deciso di testare, sempre sul sangue, kit con metodica ELISA, dotata di maggiore sensibilità e specificità diagnostica. I nuovi test ELISA sierologici marcati CE-IVD di una ditta con esperienza nel settore dell’infettivologia sono stati utilizzati su piattaforma automatizzata.
Cosa si intende per metodica ELISA?
“È un test diagnostico costituito da una micropiastra formata da 96 pozzetti. Il campione di ogni paziente viene posto in un singolo pozzetto sulla cui superficie è legato l’antigene, una porzione della proteina spike del SARS-CoV-2 (dominio S1). Nel caso in cui la persona sia entrata in contatto con il virus e il suo sistema immunitario abbia prodotto gli anticorpi, questi si legheranno alla proteina virale contenuta nel pozzetto e così possiamo avere evidenza della loro presenza”.
Quali classi anticorpali avete dosato?
“Di prassi si ricerca inanzitutto la presenza di anticorpi di classe IgM nel siero del paziente che è indice di infezione in atto (acuta). Nel caso specifico del SARS-CoV-2, recenti studi hanno dimostrato che le IgM riconoscono la proteina virale del nucleocapside (N). Essendo questa proteina (N) molto conservata in tutti i coronavirus che infettano l’uomo, il dosaggio delle IgM potrebbe incorrere in un alto rischio di cross-reattività. In altre parole, un paziente che presenta un’infezione da coronavirus diverso dal SARS-CoV-2, potrebbe risultare positivo al test che dosa gli anticorpi IgM contro quest’ultimo. Di conseguenza la ricerca delle IgM contro il SARS-CoV-2 potrebbe risultare non utile se non fuorviante, ai fini di studi epidemiologici che mirano a valutare i casi reali di questa infezione, in quanto potrebbero fornire un alto numero di risultati “falsi positivi” e quindi sovrastimare il numero reale, ed è quello che abbiamo notato tra l’altro con l’uso dei test rapidi.
Cosa avete fatto? Al fine di ottenere risultati più specifici, abbiamo deciso di testare kit ELISA che oltre a ricercare gli anticorpi di classe IgG, permettono il dosaggio delle immunoglobuline di tipo IgA, di cui si è sentito poco parlare ma che stanno assumendo un ruolo diagnostico sempre più importante nell’ambito del COVID-19 per sensibilità e specificità analitica e che sono oggetto gia’ di diverse pubblicazioni scientifiche. Ricordiamo che le IgG sono prodotte in una fase tardiva, e quindi sono considerate indicatori di infezione pregressa, mentre le IgA secretorie hanno un ruolo fondamentale nel creare una prima difesa dal virus attraverso una risposta immunitaria localizzata nella mucosa del nostro sistema respiratorio.
Abbiamo quindi valutato la possibilità che le IgA possano fornire importanti risposte, soprattutto in quei casi di infezione asintomatica o lieve, sull’avvenuto contatto del paziente con il SARS-CoV-2, attraverso la produzione di questi anticorpi secretori nelle vie nasali e nella faringe.
I kit ELISA da noi testati permettono il dosaggio di IgA e IgG prodotte contro il dominio S1 (SPIKE), che rappresenta la regione del SARS-CoV-2 più specifica e meno conservata tra i vari coronavirus che infettano l’uomo. Numerosi kit sul mercato presentano come antigene bersaglio il dominio N, cioè la regione del nucleocapside, che, come dicevo, presenta omologie con nucleocapsidi di altri coronavirus e quindi possono dare risultati aspecifici per gli studi epidemiologici.
Come avete condotto i test?
“Abbiamo dosato gli anticorpi di entrambe le classi di immunoglobuline, IgA e IgG, in diverse tipologie di pazienti: positivi al tampone con polmonite, asintomatici positivi al tampone e probabili sani. Per ciascun paziente sono stati analizzati due prelievi: il primo effettuato dopo una settimana e il secondo dopo quattro settimane dal tampone. In questo arco di tempo si ritiene che la maggior parte dei pazienti positivi al test molecolare abbiano prodotto anticorpi antivirali. Dai primi risultati si evince una più alta sensibilità delle IgA rispetto alle IgG, mentre queste ultime hanno mostrato una più elevata specificità. I dati ottenuti sono stati molto incoraggianti in quanto, nei dosaggi effettuati sui prelievi dei pazienti alla quarta settimana dalla positività del tampone, abbiamo ottenuto una sensibilità e specificità pari a circa il 98%. Quindi questi test saranno utili per il monitoraggio dei pazienti dopo infezione confermata dalla PCR su tampone nasale, per capire il momento dell’inizio della reazione immune e soprattutto per individuare soggetti con infezione recente o passata. Per quanto riguarda i tempi di esecuzione dei test ELISA da noi utilizzati, sono di circa 2 ore e 30 minuti”.
Vi attendete ulteriori sviluppi in questo campo?
“Il mondo della diagnostica di laboratorio in questo momento è un vero work in progress. Si è già in attesa, per fine maggio, di kit ancora più sensibili con metodica in chemiluminescenza, già annunciati da differenti aziende, per i quali sarà importante capire il dominio SARS-CoV-2 che utilizzano. In generale sappiamo che ci daranno il risultato delle immunoglobuline in 14 minuti. Logicamente testeremo anche questi kit per valutarne la sensibilità e la specificità, così da poter finalmente proporre a tutti i nostri pazienti un’indagine sierologica seria ed affidabile”.
Abbiamo quindi un’idea di cosa ci aspetta nei prossimi mesi?
“I laboratori non dovranno agire frettolosamente. Dovremo selezionare kit per la diagnostica di SARS-CoV-2 paragonabili dal punto di vista tecnico-scientifico, anche se prodotti da molteplici fornitori, e dovremo validarli al fine di valutare specificità e sensibilità per ridurre la variabilità inter-analisi e armonizzare i risultati ottenuti dai diversi centri. Ciò permetterà una valutazione uniforme dell’immunogenicità. Inoltre tali test risulteranno cruciali per la tracciabilità dei contatti del paziente, per la definizione del tasso di infezioni asintomatiche e per stimare la morbilità e la mortalità. Saranno infine la chiave di studi epidemiologici necessari a studiare la diffusione del virus in famiglie, RSA e altri contesti, studi importanti per lo sviluppo del vaccino e di anticorpi terapeutici. Il messaggio principale è quello di agire con cautela, un obbligo chiaro, soprattutto per un Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico come il Neuromed”.
